Hogyan határozzuk meg az aflatoxinokat?

Vizsgálati módszerek

Az aflatoxinok meghatározására számos különböző módszer létezik, amelyek nagy része kereskedelmi forgalomban elérhető.

A vizsgálati lehetőségek széles választéka lehetővé teszi, hogy az adott körülményekhez leginkább alkalmas mérési módszert tudjuk kiválasztani.

Az eljárások összetettsége, kivitelezhetősége és időigénye alapján a módszereket a két fő kategóriába soroljuk: gyors módszerek, referencia módszerek.

 

Gyors módszerek

A rövid időn belül rendelkezésre álló analitikai eredményekhez nélkülözhetetlenek a gyors-módszerek.

Ezek az eljárások alacsonyabb költségek mellett teszik lehetővé a könnyen elvégezhető vizsgálatok kivitelezését, akár a mintavétel helyszínén is.

Ha gyors vizsgálattal kívánunk meggyőződni egy tétel mikotoxin tartalmáról, akkor – a referencia módszerek alkalmazásához hasonlóan – először is biztosítani kell, hogy a minta reprezentatív legyen.

Mielőtt hozzáfognánk a minta vizsgálatához, a keresett vegyület(ek)et extrahálni kell.

A pontos mennyiségi eredmények meghatározásához a kiértékelést egy detektáló műszerrel kell elvégezni.

Míg a kvalitatív (igen/nem) vagy szemi-kvantitatív (az eredmény elhelyezkedése megadott tartományokban, pl. 0,5 – 1 ppm között) eredményeket adó teszteket többnyire szabad szemmel, vizuálisan is kiértékelhetjük.

 

Az aflatoxinok vizsgálatára kifejlesztett gyors módszereknél több különböző technológiát alkalmazhatnak.

A legelterjedtebbek az enzimmel jelölt immun-vizsgálati eljárás (ELISA), az immunkromatográfiás tesztcsík (LFD) és a kémiai módszerek.

Az immunanalitikai módszerek közé tartozó ELISA technika a vizsgált komponenssel szemben specifikus antitesteket alkalmaz az analitikai mintában található mikotoxinok kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásához.

Az eredmények megállapítása egy enzimhez kötött szín-reakción keresztül történik, ahol a szín intenzitása a vizsgált mikotoxin koncentrációjával arányos.

A mikotoxinok kimutatására jellemzően a kompetitív formátumú ELISA teszteket alkalmaznak, következésképpen a mért színintenzitás fordítottan arányos a vizsgált komponens koncentrációjával.

Ezek az ELISA vizsgálati rendszerek rövid idő alatt adnak mennyiségi eredményeket és nagyszerű szűrővizsgálati eszközök, amelyeket gyakran a mintavétel helyén is alkalmaznak.

Ugyanakkor a vizsgált anyaghoz nagyon hasonló molekulákkal szemben mutatott keresztreakciók és a különböző termékek vizsgálata során tapasztalt mátrixhatások befolyásolhatják a vizsgálati eredményeket.

Az ELISA technikával valamennyi aflatoxin, aflatoxin B1, összes aflatoxin (B1, B2, G1 és G2), aflatoxin M1 mennyiségi meghatározása elvégezhető.

A tesztek gyártói figyelembe vették a különböző régiók eltérő küszöbértékeit.

Következésképpen az aktuális betartandó követelmények alapján, legyenek azok helyi határ-értékek vagy az export célországban érvényben lévő küszöbértékek, ki lehet választani a meg-felelő érzékenységű teszteket.

Az ELISA módszerek alkalmazása során javasolt ellenőrizni a gyártó által az illető kittel validált mintamátrixok listáját.

Az ELISA technikával a mezőgazdasági alapanyagok jelentős része a gyártó által megadott útmutató alapján, különleges tisztító lépések alkalmazása nélkül, vizsgálható.

Azonban összetettebb mintatípusok, mint keveréktakarmányok, ELISA vizsgálata pontatlan eredményekhez vezethet.

 

Ennek elkerülése érdekében javasolt egyeztetni a tesztek gyártójával a konkrétan vizsgálandó minta tükrében.

Az immunkromatográfiás tesztcsíkok egy másik alkalmazható technológiaként jelennek meg a mikotoxin gyorstesztek piacán.

A módszer alapja, hogy a vizsgált komponenst egy specifikus antitesthez kapcsolva mutatjuk ki a teszt zónában, amely a tesztcsíkon található membránon helyezkedik el.

A teszt zóna mellett került kialakításra a membránon a teszt megfelelő működését igazoló kontroll zóna.

Amikor a minta kivonat a membránon áramlik, áthalad a teszt és a kontroll zónákon, a toxin koncentrációjától függően vagy mindkét(teszt és kontroll) vonal látható lesz, vagy csak a kontroll vonal.

A tesztcsíkot értékelhetjük szabad szemmel, vizuálisan vagy olvasó műszer segítségével.

Ha mennyiségi (kvantitatív) eredményekre van szükségünk a kiértékelést egy műszerrel (reflektanciás fotométer) végezzük el, amely méri a teszt és a kontroll vonalak intenzitását, majd ezek alapján kiértékeli az eredményeket.

Az immunkromatográfiás tesztcsík egy gyors, könnyen elvégezhető technika, ideális és költséghatékony akár egy minta vizsgálatára is, és a mintavétel helyén elvégezhető.

Az ELISA technikához hasonlóan a keresztreakciók és az egyes termékek vizsgálata során felmerülő mátrixhatások korlátozzák a tesztcsík alkalmazhatóságát.

Az immunkromatográfiás tesztcsíkok kvalitatív és kvantitatív formában is elérhetőek az aflatoxinok meghatározására.

Ezek a tesztek alap-vetően egyszerű mintamátrixokra lettek validálva, azaz használatuk alapanyagok szűrővizsgálatára javasolt.

Az aflatoxinok meghatározása során alkalmazott kémiai tesztekre a legelterjedtebb példát a fluorimetriás vizsgálati rendszerek jelentik.

Az extrakciót követően egy tisztító lépéssel el kell távolítani a mintából a vizsgálatot megzavaró komponenseket, majd egy származékképzéssel felerősíteni a vizsgált anyag fluoreszcens tulajdonságait.

 

A gerjesztés hatására a tisztított analit által kibocsátott fényt egy fluoriméterrel értékeljük.

Ezt a technikát jellemzően az aflatoxinok vizsgálata során alkalmazzák, mert ez a mikotoxin csoport erős, természetes fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkezik.

Egy ilyen, mennyiségi meghatározásra alkalmas, alacsony költségek mellett elvégezhető teszttel rövid idő alatt kaphatunk eredményt, akár egy mintára is.

Ugyanakkor a módszer alkalmazása a fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkező komponensekre korlátozódik és egyes termékek vizsgálata során mátrixhatásokat tapasztalhatunk, amelyek befolyásolhatják az analitikai eredményeket.

A flourimetriás tesztek összes aflatoxin (B1, B2, G1 és G2) meghatározására kínálnak gyors és megbízható alternatívát.

 

 

Referencia módszerek

Amennyiben olyan mátrixot vizsgálunk, amely összetettsége következtében, nem szerepel a tesztgyártók által validált anyagok listáján vagy egy gyorsteszt eredményét kívánjuk megerősíteni, a mintát referencia módszerek alkalmazásával kell megvizsgálnunk.

Az aflatoxinok meghatározására kidolgozott referencia módszerek kromatorgáfián, azon belül is az intenzív folyadékkromatográfián (HPLC) alapulnak.

A módszerek közötti különbséget az elválasztást követően alkalmazott detektor típusa, illetve a fluoreszcens detektálás esetén a származékképzés módja adja.

Az aflatoxinok meghatározása során HPLC-FLD és LC-MS/MS csatolt rend-szereket alkalmazhatnak.

Amennyiben fluoreszcens detektor segítségével határozzák meg az elválasztott kopmonenseket az aflatoxin B1 és G1 természetes fluoreszcens tulajdonságainak növeléséhez oszlop utáni származékképzésre van szükség.

Ez a származékképzés több módon is kivitelezhető: elektrokémiai vagy fotokémiai elven.

Az elekrokémiai származékképzés során hatóanyagként alkalmazhatnak tri-fluór-ecetsavat vagy K-bromidot.

Ugyanakkor az agresszív vegyszerek, amelyek lerövidítik a műszerek és kapillárisok élettartamát, kiválthatóak fotokémiai származékképzéssel.

Ez utóbbi eljárás alapját az tény képezi, hogy 254 nm hullámhosszú UV fénnyel történő besugárzás hatására az aflatoxin B1 és G1 komponensek fluoreszcens tulajdonságai az elektrokémiai származékképzéssel egyenértékű módon növekszenek meg (Papadopoulou – Bouraoui et al, 2002).

A tejben és tejtermékekben előforduló aflatoxin M1 vizsgálata esetén nincs szükség származékképzésre, hiszen ez a komponens HPLC-FLD műszer összeállítással kellő érzékenységgel vizsgálható.

A HPLC műszerekre jellemző a magas érzékenység.

Ennek következtében a jól értékelhető eredmények érdekében a mintaextraktumot javasolt tisztítani a HPLC oszlopra történő injektálás előtt.

 

A tisztítás történhet szilárd fázisú extrakciós (SPE) oszloppal vagy immun affinitás elvén működő oszloppal.

Az SPE oszlopok esetében az oszlop töltőanyaga megköti az esetleges interferenciát okozó anyagokat a mintaoldatból, és csak a vizsgálat szempontjából releváns anyagokat engedi az oszlopon áthaladni.

A tisztítás hatékonysága az extrakciós oldószer, a mintamátrix és az oszlop töltőanyagának kölcsönhatásain múlik.

Az immun tisztító oszlopok a vizsgálni kívánt mikotoxinokkal szemben szelektív antitesteket tartalmaznak, amelyek az oszlopban található gélben helyezkednek el.

Miután a mintaextraktumot felvisszük az oszlopra, az antitestek megkötik az abban található aflatoxinokat.

Ezt követően a gyártó által kidolgozott alkalmazási útmutató szerint az oszlopot javasolt átmosni például desztillált vízzel, hogy a nem kötődött anyagokat eltávolítsuk.

A mosást követően a gélből, amely ideális eset-ben már csak a megkötött mikotoxinokat tartalmazza, erős szerves oldószerrel (pl. 100% metanol) leoldjuk a mikotoxinokat.

A módszer érzékenységének a növelése érdekében az eluátumból célszerű elpárologtatni az oldószert, majd a bepárolt mikotoxint feloldani a HPLC mobil fázisban mielőtt injektáljuk azt.

A referenciavizsgálatok között meg kell említeni a mikotoxin analitikában is egyre szélesebb körben alkalmazott LC-MS/MS rendszereket, amelyek a legfejlettebb analitikai színvonalat képviselik.

Léteznek olyan multitoxin eljárások, amelyekkel a törvényileg szabályozott mikotoxinok (12 komponens) mennyisége egy mintából 15 perc alatt meghatározható.

Ezeknek a rendkívüli hatékonysággal rendelkező műszereknek a szélesebb körben való elterjedését, a magas áruk és a szakszerű üzemeltetésre, módszerfejlesztésre alkalmas személyzet költsége akadályozza.

 

 

Mintavétel

Bármilyen vizsgálati módszert is választunk az aflatoxinok mérésére, nem hagyhatjuk figyelmen kívül a mikotoxinok meghatározásának egyik kulcsfontosságú elemét, a mintavételt.

A mintavétel egy statisztikai eljárás, amely során egy nagyobb tételből kijelölünk egy meghatározott mennyiségű mintát olyan módon, hogy a vizsgált paraméter aránya és eloszlása meg-egyező legyen, mind az alapsokaságban (ellenőrzött tétel), mind az eltávolított részben (minta).

Majd a mintát vizsgálatoknak vetjük alá, hogy annak eredményei alapján az alapsokaságra megalapozott következtetéseket vonhassunk le.

A mikotoxinok vizsgálata egy összetett folyamat, amely alapvetően három részből áll:

• a vizsgálandó tételből véletlenszerűen számos kisebb mintát veszünk, majd ezeket egyetlen nagy „tételmintában” összesítjük
• a teljes tételmintát finom szemcseméretűre őröljük és reprezentatív rész-mintavételezéssel kiveszünk belőle egy kisebb mennyiséget, az „analitikai mintát”
• az analitikai mintából extrakcióval kivonjuk a mikotoxinokat, végül meghatározzuk azok mennyiségét

Az elmúlt időkben a mikotoxinok meghatározására kidolgozott analitikai eljárások folyamatos fejlődését figyelhettük meg.

Ugyanakkor, még ha elfogadott vizsgálati eljárással is dolgozunk, számolnunk kell azzal, hogy minden egyes említett lépést változékonyság terhel.

Számos tudós által elvégzett kutatás igazolja, hogy rendszerint a mintavétel a legjelentősebb hibaforrás a mikotoxinok vizsgálata során.

 

Például az aflatoxin vizsgálatokat terhelő hiba közel 90%-a a mintavételhez köthető.

A mikotoxinok vizsgálata során felmerülő jelentős mintavételi hibák két fő tényezőre vezethetők vissza: a mikotoxinok koncentrációja nagyon alacsony az ellenőrzött termékekben (a „ppb probléma”), valamint eloszlásuk nem egyenletes a vizsgált tételekben.

Annak ellenére, hogy egyes gabonaszemekben a mikotoxinok szintje kiugróan magas, összességében egy nagyobb gabonatételben a mikotoxin koncentráció általában nagyon alacsony.

Az általánosságban használt mértékegység „parts per billion” (ppb – 1 rész az egy milliárdból).

Nem hagyhatjuk figyelmen kívül azonban, hogy az aflatoxinok már ilyen alacsony koncentrációban is hatással vannak az emberek és állatok egészségére!

Ellentétben a fehérjékkel vagy a nedvességtartalommal, a mikotoxinok nem találhatóak meg minden gabonaszemben.

Szélsőséges esetekben a mikotoxinok csak néhány kalászon vagy gabonaszemen vannak jelen egy egész gabonatáblán.

Ez azt jelenti, hogy míg egyes szemekben magas a toxinok szintje, addig más szemek egyáltalán nem tartalmaznak toxinokat.

Ez annak a következménye, hogy a penészgombák nem egyenletesen nőnek a szántóföldeken vagy a gabonatárolókban.

Így a mikotoxinok is hajlamosak koncentrálódásra foltokban, úgynevezett gócpontokban, mialatt a tétel fennmaradó része toxinoktól mentes.

Ugyanakkor minél nagyobb mértékű a szennyezettség, annál valószínűbb az egyenletesebb eloszlás.

Ellenkező esetben, amikor egy toxin koncentrációja alacsony egy gabonatételben, az egyenlőtlen eloszlás fokozottabban nyilvánul meg.

 

A helyesen elvégzett vizsgálat során az ellenőrzött tétel átlagos szennyezettségét határozzuk meg.

Ha nem a megfelelő mintavételi eljárást követjük, akkor a vizsgálati eredmény valószínűleg alacsonyabb lesz a tételre jellemző, valós mikotoxin koncentráció értéknél (pl. ha kizárólag toxin-mentes vagy alig szennyezett területekről történik a mintavétel) vagy épp ellenkezőleg, magasabb lesz annál (amikor a „gócpontokból” vesszük a mintát).

A fals negatív eredmények igen gyakoriak a mikotoxinok vizsgálatakor, amely nagyrészt a nem megfelelő mintavételnek és minta előkészítésnek a következménye.

Amikor kevés egyedi mintát veszünk vagy a teljes tételminta túl kicsi, sokkal nagyobb az esélye, hogy „elhibázzuk” a szennyezett gabonaszemeket, mint annak, hogy pont eltaláljuk azokat és belekerülnek a vizsgált mintába.

Az ilyen típusú eredmények akkor is előfordulnak, amikor a teljes tételmintát részegységekre osztják még a darálás előtt.

A fals negatív eredmények normális esetben 5% körüli szinten mozognak, de elérhetik akár a 90%-ot is!

Másrészről a fals pozitív eredmények magasabbak, mint a reprezentatív érték.

Ez a fajta eredmény kevésbé gyakori, mint a fals negatív.

Ugyanakkor mind a fals negatív, mind a fals pozitív eredmények károsak, hiszen jelentős gazdasági veszteségek forrásai lehetnek

A helyes mintavétel jelentősége akkor válik nyilvánvalóvá, amikor végiggondoljuk, hogy például egy vasúti kocsi 55-80 t, egy teherautó pótkocsija pedig kb. 20 t kukoricát tartalmaz és ebből 20-50 g ledarált mintát vizsgálunk, amelynek tükröznie kell az egész tételt.

 

Ahhoz, hogy biztosítani tudjuk a vizsgált minta reprezentativitását, megfelelő mintavételezési technikákat kell alkalmazni.

Egy vasúti vagonban vagy teherautóban szállított gabona legfelső rétegéből vételezett minta vagy egy a szállítóeszköz ürítése során vett „vödör” minta NEM reprezentatív az ellenőrzött tételre vonatkozóan, ezért használatuk nem javasolt.

Azáltal, hogy a gabonaáramnak csak egy részét mintázzák, a mintavételt végző személyek szintén befolyással lehetnek arra, hogy a minta mennyire jellemzi a vizsgált tételt.

Ezért a lapáttal vagy kézzel történő mintavétel nem megengedett hivatalos vizsgálatok során.

Az olyan alkotóelemek, mint törtszemek vagy idegen anyagok, eloszlása általában nem egyenletes a teljes rakományban.

Amikor a gabonát egy tárolóba (teherkocsi, vagon vagy siló) ürítik, az összetevők elkülönülnek méretük, sűrűségük és alakjuk szerint.

Betárolás során a kisebb méretű részecskék a középpont közelében koncentrálódnak, a nagyobb méretű anyagok és szemcsék pedig a tároló külső része felé vándorolnak.

 

Kitároláskor fordított szegmentáció figyelhető meg.

Ezek a jelenségek magyarázatot adnak arra, miért kulcsfontosságú a helyes mintavételi séma alkalmazása és az egyedi részminták kellően magas száma annak biztosítására, hogy a minta valóban az ellenőrzött tétel jellemzőivel rendelkezzen.

Mikotoxinokkal kapcsolatosan gyakran találkozunk a következő kérdéssel: „Mi a legjobb módszer ennek vagy annak a toxinnak a vizsgálatára?”

Sokan úgy vélik, hogy kizárólag a legkorszerűbb, nagy értékű műszeres vizsgálatok révén kaphatunk pontos eredményeket.

Csak a legnagyobb érzékenység, szelektivitás és a legalacsonyabb kimutatási határ lehet elég jó.

Kizárólag abban az esetben, ha kellő figyelmet fordítunk a mintavételezésre és felelős módon végezzük azt, jelenthetjük ki, hogy a költséges vizsgálati technológia nem kidobott pénz!