Mikotoxin diagnosztizálási hibák minimalizálása – példák és ellenpéldák a gyakorlatban

Mikotoxinokkal kapcsolatosan gyakran találkozunk a következő kérdéssel: „Mi a legjobb módszer ennek vagy annak a toxinnak a vizsgálatára?” Sokan úgy vélik, hogy kizárólag a legkorszerűbb, nagy értékű műszeres vizsgálatok révén kaphatunk pontos eredményeket, vagy csak a legnagyobb érzékenység, szelektivitás és a legalacsonyabb kimutatási határ lehet elég jó.

Azonban az igazsághoz hozzá tartozik, hogy helyes mintavétel hiányában hiába fordítjuk dollárok vagy eurók millióit vizsgálati műszerekre, az eredmény hamis lesz.

„Vegyen egy mintát és küldje be a laborba”: ez valóban egyszerűen hangzik és valójában az is lenne, ha csapvizet vizsgálnánk.

Azonban mikotoxinok esetében az olyan mintavétel, amely végül kielégítő analitikai eredményhez vezet, természetesen nem ennyire egyszerű.

Mivel a mikotoxinok eloszlása a gabonákban és takarmányokban nem egyenletes, a helyes mintavétel komoly kihívást jelent.

Az egyetlen helyről történő mintavétel az esetek többségében „fals negatív” eredményekhez vezet, hiszen sokkal könnyebb elhibázni az úgynevezett mikotoxin gócpontokat.

Ugyanakkor néhány esetben „fals pozitív” eredményeket kaphatunk, amikor a mintavétel egy ilyen gócpontból történik.

Kizárólag abban az esetben, ha kellő figyelmet fordítunk a mintavételezésre és felelős módon végezzük azt, jelenthetjük ki, hogy a költséges vizsgálati technológia nem kidobott pénz!

Mivel a mikotoxinok láthatatlanok, szagtalanok és íztelenek, az egyetlen módja annak, hogy meghatározzuk, vajon a gabona vagy a takarmány tartalmazza-e ezeket a nem kívánatos vegyületeket, az, hogy vizsgáljuk őket.

Bár kiváló analitikai eljárások állnak rendelkezésre, mégis nehéz pontos és torzítatlan becsléseket adni egy nagy, ömlesztett tétel mikotoxin koncentrációjára vonatkozóan.

Ennek az oka a teljes mikotoxin vizsgálati eljáráshoz köthető nagymértékű változékonyság.

A mikotoxinok vizsgálata egy összetett folyamat, amely alapvetően három részből áll:

• a vizsgálandó tételből véletlenszerűen számos kisebb mintát veszünk, majd ezeket egyetlen nagy „tételmintában” összesítjük.
• a teljes tételmintát finom szemcseméretűre őröljük és reprezentatív rész-mintavételezéssel kiveszünk belőle egy kisebb mennyiséget (5-25 g), az „analitikai mintát”.
• Ezt követően az analitikai mintából extrakcióval kivonjuk a mikotoxinokat, végül meghatározzuk azok mennyiségét.

Az elmúlt időkben a mikotoxinok meghatározására kidolgozott analitikai eljárások folyamatos fejlődését figyelhettük meg.

Ugyanakkor, még ha elfogadott vizsgálati eljárással is dolgozunk, számolnunk kell azzal, hogy minden egyes említett lépést változékonyság terhel.

Számos tudós által elvégzett kutatás igazolja, hogy rendszerint a mintavétel legjelentősebb hibaforrás a mikotoxinok vizsgálatakor.

Például az aflatoxin vizsgálatok során előforduló hiba közel 90%-a a mintavételhez köthető.

Ahogy pénzt és időt fordítunk a mikotoxinok szintjének meghatározására, a megfelelő mintavételezésre fordítandó többlet időmennyiség döntő jelentőségű a megismételhető mikotoxin vizsgálati eredmények érdekében.

A mikotoxinok vizsgálata során felmerülő jelentős mintavételi hibák két fő tényezőre vezethetők vissza: a mikotoxinok koncentrációja nagyon alacsony az ellenőrzött termékekben (a „ppb probléma”), valamint eloszlásuk nem egyenletes a vizsgált tételekben.

Annak ellenére, hogy egyes gabonaszemekben a mikotoxinok szintje kiugróan magas, összességében egy nagyobb gabona tételben a mikotoxin koncentráció általában nagyon alacsony.

Az általánosságban használt mértékegység „parts per billion” (ppb – 1 rész az egy milliárdból).

Ezeket az alacsony szinteket néhány példa tükrében az alábbi felsorolás szemlélteti.

Ne feledje azonban, hogy a mikotoxinok már ilyen alacsony koncentrációkban is hatással vannak az emberek és állatok egészségére!

1 ppb…

• 1 db 1.000.000.000-ban
• 1 másodperc 32 évben
• 1 szem 22 kg homokban
• 1 kukoricanövény 17.000 hektár területű kukoricaföldön
• 1 kukoricaszem 3,5 vasúti kocsi kukoricarakományban

Egyenlőtlen eloszlás

Ellentétben a fehérjékkel vagy a nedvességtartalommal, a mikotoxinok nem találhatóak meg minden gabonaszemben.

Szélsőséges esetekben a mikotoxinok csak néhány kalászon vagy gabonaszemen vannak jelen egy egész gabonatáblában.

Ez azt jelenti, hogy míg egyes szemekben magas a toxinok szintje, addig más szemek egyáltalán nem tartalmaznak toxinokat.

Ez annak a következménye, hogy a penészgombák nem egyenletesen nőnek a mezőkön vagy a gabonatárolókban.

Így a mikotoxinok is hajlamosak koncentrálódásra foltokban, úgynevezett gócpontokban, mialatt a tétel fennmaradó része toxinoktól mentes.

Ugyanakkor minél nagyobb mértékű a szennyezettség, annál valószínűbb az egyenletesebb eloszlás.

Ellenkező esetben, amikor egy toxin koncentrációja alacsony egy gabonatételben, az egyenlőtlen eloszlás fokozottabban nyilvánul meg.

Mi a „fals negatív” és a „fals pozitív” eredmény?

A helyesen elvégzett vizsgálat során az ellenőrzött tétel átlagos szennyezettségét határozzuk meg.

Ha nem a megfelelő mintavételi eljárást követjük, akkor a vizsgálati eredmény valószínűleg alacsonyabb lesz a tételre jellemző, valós mikotoxin koncentráció értéknél (pl. ha kizárólag toxin-mentes vagy alig szennyezett területekről történik a mintavétel) vagy épp ellenkezőleg, magasabb lesz annál (amikor a „gócpontokból” vesszük a mintát).

A fals negatív eredmények igen gyakoriak a mikotoxinok vizsgálata során, amely nagyrészt a nem megfelelő mintavételnek és minta előkészítésnek a következménye.

Amikor kevés egyedi mintát veszünk vagy a teljes tételminta túl kicsi, sokkal nagyobb az esélye, hogy „elhibázzuk” a szennyezett gabonaszemeket, mint annak, hogy pont eltaláljuk azokat és belekerülnek a vizsgált mintába.

Az ilyen típusú eredmények akkor is előfordulnak, amikor a teljes tételmintát részegységekre osztják még a darálás előtt.

A fals negatív eredmények normális esetben 5% körüli szinten mozognak, de elérhetik akár a 90%-ot is!

Másrészről a fals pozitív eredmények magasabbak, mint a tétel átlagos, valós szennyezettsége.

Ez a fajta eredmény kevésbé gyakori, mint a fals negatív.

Ugyanakkor mind a fals negatív, mind a fals pozitív eredmények károsak, hiszen jelentős gazdasági veszteségek forrásai lehetnek.

Fals negatív…

• Mikotoxin vizsgálati költségek = kidobott pénz
• További szállítási és kártérítési költségek merülhetnek fel, amikor az alapanyagot feldolgozó üzem a későbbiek során határértéket meghaladó mikotoxin szennyezettséget mér a tételből és visszautasítja, majd visszaküldi azt az eladó részére.
• Az eladó veszít hitelességéből és megbízhatóságából.
• Költséges jogi eljárást vonhat maga után, ha az alapanyag feldolgozásra kerül és az így előállított élelmiszer vagy takarmány egészségkárosító hatásokat vált ki.

Fals pozitív…

• Jó minőségű gabona alacsony áron kerül eladásra.
• Jó minőségű gabona hígítása/keverése vagy kezelése fölösleges költségeket von maga után.
• A pontatlan eredmények rossz fényt vetnek az egész vizsgálati programra és megakadályozzák a gabonakereskedőket abban, hogy terményeiket eladásra kínálják.

A körültekintő mintavételezés döntő fontosságú a pontos analitikai eredményekhez

A mintavétel az a folyamat, amely során egy nagyobb tételből vizsgálat céljából kiveszünk egy meghatározott mennyiséget olyan módon, hogy a vizsgált paraméter aránya és eloszlása megegyező legyen mind az alapsokaságban (ellenőrzött tétel), mind az eltávolított részben (minta).

„A helyes mintavétel jelentősége akkor válik nyilvánvalóvá, amikor végiggondoljuk, hogy például egy vasúti kocsi 55-80 t, egy teherautó pótkocsija pedig kb. 20 t kukoricát tartalmaz és ebből 5-25 g ledarált mintát vizsgálunk, amelynek tükröznie kell az egész tételt.”

Ahhoz, hogy biztosítsuk a vizsgált minta reprezentativitását, megfelelő mintavételezési technikákat kell alkalmazni.

Egy vasúti vagonban vagy teherautóban szállított gabona legfelső rétegéből vételezett minta vagy egy a szállítóeszköz ürítése során vett „vödör” minta NEM reprezentatív az ellenőrzött tételre vonatkozóan, ezért használatuk nem javasolt.

Azáltal, hogy a gabonaáramnak csak egy részét mintázzák, a mintavételt végző személyek szintén befolyással lehetnek arra, hogy a minta mennyire jellemzi a vizsgált tételt.

Ezért a lapáttal vagy kézzel történő mintavétel nem javasolt a mikotoxin vizsgálatokhoz.

Az olyan alkotóelemek, mint törtszemek vagy idegen anyagok, eloszlása általában nem egyenletes a teljes rakományban.

Amikor a gabonát egy tárolóba (teherkocsi, vagon vagy siló) ürítik, az összetevők elkülönülnek méretük, sűrűségük és alakjuk szerint.

Betárolás során a kisebb méretű részecskék a középpont közelében koncentrálódnak, amíg a nagyobb méretű anyagok és szemcsék a tároló külső része felé vándorolnak.

Kitároláskor fordított szegmentáció figyelhető meg.

Ezek a jelenségek magyarázatot adnak arra, miért kulcsfontosságú a helyes mintavételi séma alkalmazása és az egyedi minták kellően magas száma annak biztosítására, hogy a minta valóban az ellenőrzött tétel jellemezőivel rendelkezzen.

A következő tanulmányban látható, hogy a megfelelő mintaméret mekkora jelentőséggel bír az analitikai eredmények pontossága szempontjából.

A mintákat egy aflatoxinnal 20 ppb koncentrációban szennyezett kukoricát tartalmazó pótkocsiról vették.

Amikor a minta mennyisége túl kevés volt, a toxint vagy egyáltalán nem sikerült megtalálni, vagy csak a valós szennyezettségnél jóval alacsonyabb koncentrációt tudtak meghatározni.

A vizsgálati eredmények szóródása a minta méretének függvényében (Romer Labs® tanulmány)

Ahhoz, hogy egy mintát reprezentatívnak értékeljünk, az alábbi feltételeknek kell megfelelnie:

• a tételből megfelelő mintavevő eszközzel vételezett: nem mozgó gabonatételből réteg-mintavevő rúddal, mozgó gabonából mintaosztó elven működő mechanikus vagy „pelikán” típusú mintavevővel.
• előre meghatározott mintavételi sablon alapján olyan eljárással vételezett, amely biztosítja, hogy az ellenőrzött tétel minden része mintázására kerül.
• a tétel nagyságának és a mintázott anyagnak megfelelő méretű. Pl. egy pótkocsiról vagy vasúti kocsiból kukorica esetén 2,5 – 5kg minta, búza vagy árpa esetén 1,5 – 2,5 kg minta vételezése szükséges. Fontos, hogy ez az összesített minta egyedi részmintákból tevődjön össze, amelyek a vizsgált tétel különböző pontjairól származnak.
• megfelelő jelöléssel azonosított a mintavételi zsákon.
• a további kezelés során ügyelni kell a reprezentativitás fenntartására. Ez azt jelenti, hogy a mintákat száraz, hűvös helyen kell tárolni két- vagy háromrétegű papír vagy levegőáteresztő textil zsákokban. Soha ne szállítsa a mintákat műanyag zsákokban, mert az elősegítheti a penésznövekedést, ha a minta nedvességtartalma meghaladja a 14%-ot.

Szakkifejezések:

• tételminta:

több kis minta (egyedi minta) összege, amelyeket véletlenszerűen vettek az ellenőrizni kívánt tételből

• analitikai minta:

a vizsgálatra szánt minta, amelyet a ledarált tételmintából veszünk ki

• véletlenszerű mintavétel:

a tétel minden egyes alkotóelemének (minden gabonaszemnek) egyenlő eséllyel kell rendelkeznie arra, hogy a vételezett mintába bekerüljön

• megismételhetőség

egy adott tétel ismételt vizsgálatai során ugyanazt az eredményt kell kapnunk

Mintavétel keveréktakarmányokból

Amikor keveréktakarmányokból veszünk mintát mikotoxin vizsgálatokhoz, két helyzet állhat elő:

• Egy vagy több takarmány összetevő szennyezett volt mikotoxinokkal a keverék összeállításakor: A mikotoxinok eloszlása egyenletesebb a takarmányban, mint az a szennyezett alapanyagokban megfigyelhető volt. Ennek az oka, hogy az adott összetevő meg lett darálva és el lett keverve a takarmányban. Keveréktakarmányok esetében 1 kg minta kellően reprezentatív.
• A takarmányban található mikotoxinok a bekeverés után keletkeztek a nem megfelelő tárolási körülmények következtében (14% vagy magasabb nedvességtartalom): A mikotoxinok általában egyenlőtlenebb eloszlást mutatnak. A penészek először a takarmánytároló nedvesebb területein kezdenek el szaporodni, majd növekedésük következtében lassan elindulnak a kevésbé nedves területek irányába. Ebben az esetben javasolt 1 kg mintát venni a tároló nedvesebb zónáiból (általában a külső élekből és sarkokból) valamint 1 kg mintát a tároló középső részeiből. Ugyanakkor, a nagyobb biztonság érdekében, mindig feltételezze azt, hogy a vizsgált tételen belül nem egyenletes az eloszlás.

Tanyi Ervin